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• 제목

  단백질 농도 정량 방법 (1) - Spectrophotometric Method.

• 작성자

  이매스

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Spectrophotometric Assays?

 

Spectrophotometric assays of protein concentration can be more reliable
than estimating the amount of protein by staining. The sample, however,
must be in solution, and must contain only the protein of interest.
Four commonly used spectrophotometric methods are the:

Lowry 법 - copper 의 결합을 통해 산화 정도가 단백질량에 비례하여 반응하여 blue Sky 발색을 보인다.

 

이런 경우의 단백질의 특성을 보일때는 피하는것이 좋다. 산화효소 등의 기질을 산화 시킬 수 있는 단백질의 경우에는 피하고 단백질이 녹여져 있는 완충액에 DTT, 2-mercaptoethanol 등 환원 성질이 있는 시약이 포함되거나 phosphate 등 이 높은 농도로 녹여져 있는 완충액에서는 투석을 통해 낮은 농도로 낮춘 후, 단백질 정량을 시도한다.

 

Bradford 법 - Coomassie Blue Dye 의 단백질 내 특정 아미노산 잔기의 결합력을 이용하여 정량하는 방법이다.

 

Coomassie Blue Dye 가 결합하는 특정 아미노산의 비율이 낮은 단백질인 경우에는 이 정량법을 피하는것이 좋다. - 실제 실험을 하다보면 이런 아미노산 조성을 모르는 경우도 있기 때문에 단백질 전기영동을 하여 Coomassie Blue Dye 가 포함되어 있는 staining buffer 를 이용해 염색하였을 때, 분석하고자 하는 단백질의 band 를 확인할 수 있으면 이 방법을 통한 정량이 가능하다. 반면 Bradford Reagent 의 간섭현상에 의한 정량의 정확성은 많이 떨어진다.

 

Absorbance 법 (A280/A260) - 방향족 아미노산의 UV 흡광 파장 정도를 이용하여 정량하는 방법이다.

 

말 그대로 단백질이 녹여진 상태의 UV 파장대 260/280 nm 의 동시 측정을 통해 단백질을 정량하는 방법이다. 일반적으로 BSA (Bovine Serum Albumin) 단백질이 생리식염수에 1mg/ml 이 녹여져 있을 때, 280nm 에서의 흡광도 값은 대략 1.0정도를 나타낸다. 단백질 중 polypeptide 에 가까운 저분자 단백질이나 방향족 아미노산의 비율이 낮은 (일반적으로 3~5%) 단백질의 경우에는 이 방법을 피하는것이 좋다.

 

 

BCA 법 - Lowry 법과 유사한 산화된 copper 의 결합정도를 보고 발색정도를 통해 단백질을 정량하는 방법이다.

 

이 들 정량법의 공통 점은 직, 간접적으로 단백질의 량을 빛의 산란률 정도를 유도하여 측정하는 방법이므로 정확한 정량법이라기 보다 대략적인 단백질 농도를 산정하여 다음 실험 과정의 준비 단계라 할 수 있다.